PCR چیست؟

• واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) در ابتدا در سال 1983 توسط بیوشیمیدان آمریکایی کری مولیس توسعه یافت. او در سال 1993 جایزه نوبل شیمی را به خاطر کارهای پیشگامانه خود دریافت کرد.
• PCR در زیست شناسی مولکولی برای ساختن کپی های زیادی از (تقویت) بخش های کوچک DNA استفاده می شود ^؟ یا یک  ژن ^؟ .
• با استفاده از PCR می توان هزاران تا میلیون ها نسخه از یک بخش خاص از DNA را از مقدار بسیار کمی DNA تولید کرد.
• PCR ابزار رایجی است که در آزمایشگاه های تحقیقاتی پزشکی و بیولوژیکی استفاده می شود. در مراحل اولیه پردازش DNA برای توالی یابی استفاده می شود ^؟ برای تشخیص وجود یا عدم وجود یک ژن برای کمک به شناسایی  عوامل بیماری زا ^؟ در طول عفونت، و هنگام تولید پروفایل های DNA پزشکی قانونی از نمونه های کوچک DNA.

PCR چگونه کار می کند؟

• اصول پشت هر PCR، صرف نظر از نمونه DNA، یکسان است.
• برای راه اندازی PCR به پنج “مواد تشکیل دهنده” اصلی نیاز است. در ادامه توضیح خواهیم داد که هر کدام از اینها دقیقاً چه کاری انجام می دهند. اینها هستند:
  • الگوی DNA که باید کپی شود
  • پرایمرها، بخش‌های کوتاهی از DNA که واکنش PCR را آغاز می‌کنند، طراحی شده برای اتصال به هر دو طرف بخش DNA که می‌خواهید کپی کنید.
  • بازهای نوکلئوتیدی DNA ^؟ (همچنین به عنوان dNTP شناخته می شود). بازهای DNA (A، C، G و T) بلوک های سازنده DNA هستند و برای ساخت رشته جدید DNA مورد نیاز هستند.
  • آنزیم تاق پلیمراز ^؟ برای افزودن به پایگاه های DNA جدید
  • بافر برای اطمینان از شرایط مناسب برای واکنش.
• PCR شامل یک فرآیند گرمایش و خنک کننده به نام چرخه حرارتی است که توسط ماشین انجام می شود.

سه مرحله اصلی وجود دارد:

• 1. دناتوره شدن – زمانی که DNA الگوی دو رشته ای حرارت داده می شود تا به دو رشته منفرد جدا شود.
  2. بازپخت – زمانی که دما کاهش می یابد تا پرایمرهای DNA بتوانند به DNA الگو بچسبند.
  3. گسترش – زمانی که دما افزایش می یابد و رشته جدید DNA توسط آنزیم Taq polymerase ساخته می شود.
• این سه مرحله 20-40 بار تکرار می شود و هر بار تعداد کپی های DNA دو برابر می شود.
• یک واکنش کامل PCR را می توان در چند ساعت یا حتی کمتر از یک ساعت با دستگاه های خاص با سرعت بالا انجام داد.
• پس از تکمیل PCR، می توان از روشی به نام الکتروفورز برای بررسی کمیت و اندازه قطعات DNA تولید شده استفاده کرد.

در هر مرحله از PCR چه اتفاقی می افتد؟

مرحله دناتوره کردن

• در این مرحله کوکتل حاوی DNA الگو و سایر اجزای اصلی تا دمای 94-95 درجه سانتیگراد گرم می شود.
• دمای بالا باعث ایجاد پیوندهای هیدروژنی می شود ^؟ بین بازها در دو رشته DNA الگو شکسته شود و دو رشته از هم جدا شوند.
• این منجر به دو رشته منفرد DNA می شود که به عنوان الگوهایی برای تولید رشته های جدید DNA عمل می کند.
• مهم است که دما در این مرحله برای مدت طولانی حفظ شود تا اطمینان حاصل شود که رشته های DNA کاملاً از هم جدا شده اند.
• این معمولا بین 15-30 ثانیه طول می کشد.

مرحله بازپخت

• در این مرحله واکنش تا دمای 50-65 درجه سانتیگراد سرد می شود. این پرایمرها را قادر می‌سازد تا از طریق پیوند هیدروژنی به مکان خاصی روی DNA الگوی تک رشته‌ای متصل شوند (دمای دقیق به دمای ذوب پرایمرهایی که استفاده می‌کنید بستگی دارد).
• پرایمرها تک رشته ای از DNA یا RNA هستند ^؟ دنباله ای که حدود 20 تا 30 پایه طول دارند.
• پرایمرها طوری طراحی شده اند که مکمل باشند ^؟ به ترتیب به بخش های کوتاه DNA در هر انتهای توالی که باید کپی شود.
• پرایمرها به عنوان نقطه شروع سنتز DNA هستند. آنزیم پلیمراز فقط می تواند بازهای DNA را به یک رشته دو رشته DNA اضافه کند. تنها زمانی که پرایمر متصل شد، آنزیم پلیمراز می تواند متصل شود و شروع به ساخت رشته مکمل جدید DNA از بازهای سست DNA کند.
• دو رشته جدا شده از DNA مکمل یکدیگر هستند و در جهت مخالف قرار دارند (از یک سر – انتهای 5′ – به سمت دیگر – انتهای 3′). در نتیجه، دو آغازگر وجود دارد – یک پرایمر جلو و یک آغازگر معکوس.
• این مرحله معمولاً حدود 10-30 ثانیه طول می کشد.

مرحله تمدید

• در طی این مرحله نهایی، گرما به 72⁰C افزایش می‌یابد تا DNA جدید توسط یک آنزیم Taq DNA پلیمراز خاص ساخته شود که بازهای DNA را اضافه می‌کند.
• Taq DNA پلیمراز آنزیمی است که از باکتری های گرما دوست گرفته شده است ^؟ ترموس آبی .
  • این باکتری به طور معمول در چشمه های آب گرم زندگی می کند، بنابراین می تواند دمای بالای 80 درجه سانتیگراد را تحمل کند.
  • DNA پلیمراز باکتری در دماهای بالا بسیار پایدار است، به این معنی که می تواند دمای مورد نیاز برای شکستن رشته های DNA را در مرحله دناتوره شدن PCR تحمل کند.
  • DNA پلیمراز بسیاری از موجودات دیگر قادر به مقاومت در برابر این دماهای بالا نیست، به عنوان مثال، پلیمراز انسانی در دمای 37 درجه سانتیگراد (دمای بدن) ایده آل عمل می کند.
• 72 درجه سانتیگراد دمای بهینه برای Taq polymerase برای ساخت رشته مکمل است. به پرایمر متصل می شود و سپس پایه های DNA را یک به یک در جهت 5 به 3 به تک رشته اضافه می کند.
• نتیجه یک رشته کاملاً جدید از DNA و یک مولکول دو رشته ای DNA است.
• مدت زمان این مرحله به طول توالی DNA در حال تقویت بستگی دارد، اما معمولاً حدود یک دقیقه طول می کشد تا 1000 پایگاه DNA (1Kb) کپی شود.

کپی توالی DNA

• این سه فرآیند چرخه حرارتی 20-40 بار تکرار می شوند تا تعداد زیادی کپی از توالی DNA مورد نظر تولید شود.
• قطعات جدیدی از DNA که در طی PCR ساخته می‌شوند نیز به عنوان الگوهایی عمل می‌کنند که آنزیم DNA پلیمراز می‌تواند به آن متصل شود و شروع به ساخت DNA کند.
• نتیجه تعداد زیادی کپی از بخش DNA خاص است که در مدت زمان نسبتاً کوتاهی تولید می شود.